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讲解拉曼图像

拉曼图像(有时称为“扫描图像”)描绘样品上或样品内不同点的光谱信息变化。它可以以一维轮廓、二维图像或三维立体渲染的形式显示。通过这些图像,您可以快速查看拉曼参数如何随位置发生改变。

这个参数可以是像特定拉曼谱带的强度这样的简单参数,或者可以是通过对整个拉曼光谱进行更复杂的分析而提取的参数。

采集光谱数据并生成这些图像主要有两种方法:拉曼逐点扫描成像和拉曼直接整体成像。

拉曼逐点扫描成像

拉曼逐点扫描成像采集一个光谱的超立方体(单个文件中包含样品上每个位置的拉曼光谱),而不是一个简单的强度图像。通过分析该超立方体来生成拉曼图像。

下面是几种拉曼逐点扫描成像的方法,如:

  • 点到点逐点扫描成像
    激光聚焦成一个点。自动样品台在激光下移动样品。针对覆盖样品上指定关注区域的点阵列,按顺序采集光谱。比逐点扫描更快的扫描模式为雷尼绍StreamLineHR™和StreamHR Rapide
  • 线聚焦扫描成像
    这与点到点逐点扫描成像类似,不同的是激光照射样品上的一条线,而不是一个点。利用这个方法,您可从样品上的多个位置同时采集光谱,在节省时间的同时,还可以使用更高的激光功率,而不会损伤样品(减少曝光时间)。雷尼绍StreamLine™以一种高级、新式的模式实现了这一设想。

在扫描成像时,考虑过疏采样的潜在不利影响非常重要。逐点扫描成像则更加清楚地诠释了这一问题:如果激光光斑小于采集点之间的间距,样品的某些部分会被“遗漏”。雷尼绍利用StreamLine™ Slalom模式解决了这一问题。

从扫描成像数据生成拉曼图像

从扫描成像实验中采集到所有拉曼光谱之后,即可进行分析,生成轮廓、图像或立体渲染图。雷尼绍WiRE软件中的分析选项包括:

  • 光谱中某一频率的强度
    它生成一个与拉曼成像同等的图像。这些图像的生成速度快,但可能带有误导性,因为不可能区分所关注拉曼谱带产生的信号强度和与宽荧光背底相关的信号强度。
  • 曲线拟合参数
    数据集中的所有光谱都有一条理论曲线与拉曼谱带中的一条拟合。然后基于每条光谱的理论曲线参数生成图像。经常使用这一曲线(谱带)的中心频率或半高宽 (FWHM) 生成图像,因为它分别对样品中的应力和结晶度具有敏感性。
  • 多变量参数
    图像可以利用化学计量工具生成,例如通用主成分分析法 (PCA),或雷尼绍针对拉曼数据优化的Empty Modelling™(空模法)。Empty Modelling以图像方式揭示拉曼光谱之间的系统变化,并且突出显示了这些变化在样品上的分布。这个方法无需您对样品中存在什么做预先了解,大大地简化了分析过程。多变量分析很强大,因为它使用整个光谱的信息,而不仅仅是光谱的一部分(在某个频率的强度)或一条曲线拟合谱带。这种方法通常可生成更高质量的拉曼图像。

拉曼直接整体成像

拉曼整体成像与拍照类似;从整个关注区域同时采集光谱强度值。激光照射样品上的一个方形或圆形区域。光被过滤,只有光谱中一个较窄部分的强度被记录到探测器上。

这样的一张图像中包含的信息有限,仅仅是相关频率的光的强度。然而,这些图像的采集速度快,特别是当使用大功率激光时。因为光被分散到一个面积上,您可以使用所有的功率而不会损伤样品,而且曝光时间相对较短。

使用这种方法,通常可以生成二维图像。雷尼绍True Raman Imaging是拉曼整体成像的一个示例。

请注意,通过使用多个滤光片和/或可调谐滤光片,可采集到覆盖光谱多个点的强度值。

空间分辨率

拉曼逐点扫描成像

空间分辨率由激光光斑尺寸和样品上采集点(信号)之间的间距共同决定。

  • 激光光斑尺寸
    这是物镜放大倍数和激光波长的函数(较高的放大倍数和较短的波长产生较小的光斑尺寸)
  • 样品上采集点(采样)之间的间距
    这是样品台的函数(理想情况下,样品台应该有大行程范围,同时仍具有低至100 nm的步长,小于最小的光斑尺寸)

拉曼直接整体成像

空间分辨率由系统中光学元件的放大倍数和探测器内基本单元的尺寸决定。它最终受限于光所固有的波形本性,达到略小于微米级的水平。

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