拉曼图像能揭示什么

拉曼图像可以显示样品中不同化学和结构物质种类的分布。了解如何采集和分析拉曼图像。

拉曼成像的定性和定量分析

伪彩色拉曼图像可有效突出显示样品内的化学和结构特性分布。图像的亮度、对比度和颜色有助于展示物质成分。通过叠放多个拉曼图像，可以同时显示多种物质种类或属性的分布情况。

我们如何采集拉曼图像？

我们使用显微拉曼光谱仪，从样品的每个位置采集拉曼光谱。然后，将所有拉曼光谱保存在一个称为光谱超立方体的数据文件中。最后，分析该光谱超立方体以生成拉曼图像。

下面是几种拉曼成像方法，例如：

点聚焦
显微拉曼光谱仪将激光聚焦到样品上的一个点。我们将样品放置在自动样品台上，该样品台在激光下移动样品。光谱仪从样品上的一个点阵列中采集光谱。

比点聚焦成像更快的扫描模式为雷尼绍的StreamHR™和StreamHR™ Rapide成像技术。采用StreamHR Rapide技术进行拉曼成像，每秒可采集超过1,000个光谱点。

图表中显示的是逐点成像，分别描述了优化采样和过疏采样。

线聚焦
激光照射样品上的一条线，而不是一个点。利用这个方法，您可以从样品上的多个位置同时采集光谱，在节省时间的同时，还可以使用更高的总激光功率，而不会损伤样品。雷尼绍的StreamLine™成像技术以一种精密、新式的方式实现了这一设想。通过线聚焦成像，激光照射样品上的一条垂直线而不是一个点。

在成像时，考虑过疏采样的潜在不利影响非常重要。如果激光点或激光线小于采集点之间的间距，则会发生过疏采样。雷尼绍通过使用StreamLine技术与Slalom模式，解决了这一问题。

Streamline™成像技术结合Slalom模式，即使在使用大步长（像元）尺寸时，也能确保覆盖完整的采样区域。您可以对大样品执行快速拉曼成像，而不必担心有任何遗漏。

此拉曼成像显示了健康大鼠结肠隐窝的组织结构。我们采用主成分分析 (PCA) 方法生成了此图像。

如何分析拉曼图像？

我们可以分析在成像实验中获取的拉曼光谱，以生成一维线条轮廓、二维表面图像或三维立体渲染图。拉曼图像可以显示简单的单变量谱带参数，例如拉曼谱带的强度。您也可以对光谱超立方体中的整个拉曼光谱进行完整的多变量分析。

雷尼绍的WiRE™软件中包括许多适用于拉曼成像的数据分析选项：

光谱中某一频率的强度
这些图像的生成速度快，但可能具有误导性，因为不可能区分由所关注的拉曼谱带产生的信号强度和与宽荧光背底相关的信号强度。

曲线拟合参数
针对拉曼图像中的每个光谱，您可以拟合出每个拉曼谱带的理论曲线。您可以计算拉曼谱带参数，例如拉曼频移、谱带宽度或相对强度。拉曼图像通常显示谱带中拉曼频移的变化，这可以指示局部应力。还可以显示拉曼谱带宽度的变化，而这可以指示不同的结晶度。

多变量参数
多变量分析的功能强大，因为它使用整个光谱的信息，而不仅仅是一个拉曼谱带参数（例如，某一频率的强度或一个曲线拟合谱带）。这种方法通常可生成质量更高的拉曼图像，具有更高的化学特异性。

如果您有样品中的化学成分的参考光谱，那么您可以轻松创建拉曼图像显示各个成分的分布情况。在这种情况下，您可以使用成分分析方法，例如直接经典最小二乘法 (DCLS) 或非负最小二乘法 (NNLS)。您可以使用这些成分分析方法得出浓度估算值。

如果没有参考光谱，您可以使用非监督式化学计量方法创建拉曼图像。其中包括聚类分析、主成分分析 (PCA) 或雷尼绍EmptyModelling™软件的功能。我们可以在不知道样品成分的情况下使用这些化学计量方法。这些方法可以分析拉曼光谱之间的系统方差，以预测光谱成分。然后拉曼图像可显示样品中光谱成分的分布。

我们通常使用聚类分析和PCA来分析生物组织和细胞的拉曼图像。这些强大的化学计量方法可以检测通常不含纯生化物质的生物样品中的结构。

EmptyModelling功能是一种简单易用的多元曲线分辨 — 交替最小二乘法 (MCR-ALS) 分析工具。这种方法可以创建样品的拉曼图像，从而识别纯成分中的未知区域。这对于半导体晶圆或药物制剂等样品非常重要。